進行性假肥大性肌營養(yǎng)不良( Duchenne musculardystrophy,DMD)是一種臨床表現(xiàn)以骨骼肌進行性變性壞死為主的致死性疾病，呈X染色體連鎖隱性遺傳，在男性活嬰中的發(fā)病率約為1/3500。

進行性假肥大性肌營養(yǎng)不良遺傳模式

假肥大性肌營養(yǎng)不良的遺傳概率

這種疾病是典型的X性聯(lián)隱性遺傳，而且致病基因通常由母親攜帶，但不會發(fā)病。而對于后代，如果是男性則顯性發(fā)病，成為進行性假肥大性肌營養(yǎng)不良患者;而女性則為終身進行性假肥大性肌營養(yǎng)不良基因的攜帶者。

目前認為，DMD的發(fā)病原因主要是抗肌萎縮蛋白結(jié)構(gòu)和功能的異常。該蛋白屬于細胞膜骨架蛋白，由抗肌萎縮蛋白基因編碼，亦為本病的致病基因。患者通常在幼兒或兒童期起病，因肝功能異常進而確診該病;多在成年前因相關(guān)肌肉萎縮進一步導(dǎo)致呼吸、心臟衰竭而死亡。

該基因的突變還可引起臨床上癥狀較輕的一種亞型——貝克肌營養(yǎng)不良( Becker muscular dystrophy，BMD)，一般以12歲是否還能夠行走來區(qū)分。閱讀框規(guī)則可解釋90%的患者基因型與表型關(guān)系：即基因突變?nèi)魧?dǎo)致編碼蛋白提前終止進而產(chǎn)生截短蛋白或產(chǎn)物被降解，則將導(dǎo)致表型嚴重的DMD;未導(dǎo)致框移突變則可產(chǎn)生有部分功能的蛋白，將導(dǎo)致表現(xiàn)為表型較輕的BMD。

假肥大性肌營養(yǎng)不良

迄今為止，針對DMD/BMD仍無有效治療方法。因此，應(yīng)用簡便、準確的方法檢測致病突變及提供產(chǎn)前診斷或PGD成為預(yù)防和減少發(fā)病的唯一有效途徑。

由79個外顯子構(gòu)成的DAD基因是目前人類已知的最大基因，基因組DNA長度約為2.3 Mb，其主要的突變類型是基因外顯子拷貝數(shù)異常，以缺失型最為常見，出現(xiàn)異常頻率最高的區(qū)域為基因中央?yún)^(qū)域45～55號外顯子，另一個缺失熱點區(qū)位于基因5′端2～20號外顯子。所有患者中，大片段的缺失型占60.9%，重復(fù)型占9.1%，單核苷酸改變占20.9%。由于DMD基因突變類型多樣，且突變在不同的家系中具有獨立性，因此必須采用針對性的基因診斷方法和策略。無論是產(chǎn)前診斷還是孕前PGD，對先證者進行基因分析，明確其致病突變是制定孕前PGD實施途徑和策略的前提。

多重連接探針擴增是一種可替代傳統(tǒng)多重PCR方法對DMD患者進行外顯子缺失、重復(fù)檢測的技術(shù)，由Schouten首先提出。Laing等基于大量DMD患者基因突變分析的結(jié)果進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)當前對DMD/BMD的診斷策略普遍是先對患者進行多重連接探針擴增檢測，然后對未發(fā)現(xiàn)突變的患者進行基因組DNA序列分析，最后進行肌組織活檢確定診斷，并獲得抗肌萎縮蛋白mRNA以進行RT-PCR分析DAD基因轉(zhuǎn)錄。隨著NGS的發(fā)展，使同時對DMD基因外顯子拷貝數(shù)和點突變講行篩查變得可能。

假肥大性肌營養(yǎng)不良癥狀

由于PGD的受檢材料為單個卵裂球，其DNA含量極少，因此必須先進行DNA擴增。WGA是一組以單個或數(shù)個細胞的全部基因組進行非選擇性擴增的技術(shù)，目的是通過非傾向性的PCR擴增以指數(shù)級別增加DNA的總量。MDA方法是單基因病PGD常用的WGA方法，基本原理是采用多重置換擴增技術(shù)對基因組DNA進行穩(wěn)定擴增。利用隨機6個堿基引物在多個位點與模板DNA退火，并利用Phi29 DNA聚合酶擴增的高效率和高保真性，在DNA的多個位點同時起始復(fù)制，以原始DNA模板合成DNA，同時取代模板的互補鏈。被置換的互補鏈又成為新的模板來進行擴增，因此最終可以獲得大量高分子量的DNA，平均長度達10 kb。

DMD的PGD總體策略是盡可能采用直接診斷和間接診斷相結(jié)合的方法：首先利用SRY基因及AMEL基因等確定胚胎性別，利用STR和SNP位點確認胚胎是否攜帶致病的等位基因，即間接診斷;之后，針對不同的突變類型，先證者為缺失型患者可利用多重PCR對男性胚胎進行檢測，點突變導(dǎo)致的家系可直接對突變位點進行檢測，即直接診斷。另有10%左右無法檢出突變及重復(fù)導(dǎo)致的家系，僅能通過單體型分析的方法進行間接診斷。日本學(xué)者Nakabayashi等曾報道采用實時熒光定量PCR方法檢測一個重復(fù)型突變家系的PGD，目前國內(nèi)尚未有類似報道。

DMD基因內(nèi)部存在9個微衛(wèi)星位點，分別位于2、7、44、45、49、50、59、63、3′的內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)，為具有不同次數(shù)CA堿基重復(fù)的STR。一般選擇突變區(qū)域上下游可提供信息的STR位點作為連鎖標記進行單體型分析。過去一般使用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的方式區(qū)分雜合的連鎖標記，然而該方法耗時長，且分辨率有限，當同一位置兩個STR位點CA重復(fù)次數(shù)差距較小時無法判別。因此，可采用熒光標志引物擴增，利用測序儀毛細管電泳的方法進行單體型分析，該方法清晰直觀，可區(qū)分重復(fù)次數(shù)僅相差一次的STR位點，且具有檢測周期短的優(yōu)勢。

胚胎植入前單倍型分析(PGH)是伴隨NGS技術(shù)發(fā)展而來的新概念，與傳統(tǒng)的利用STR作為連鎖分析的標志物相比，主要的區(qū)別在于其一般選擇突變位點上下游1 Mb以內(nèi)雜合頻率較高的SNP位點作為連鎖分析的標志物，相較于傳統(tǒng)的PCR+Sanger測序方法，NGS技術(shù)在尋找SNP位點方面具有低成本、低耗時的特點。

然而，無論采取何種連鎖分析的方法，都無法回避雙等位基因中某一等位基因隨機性的擴增失敗造成的ADO現(xiàn)象。ADO給單細胞PCR造成了困擾，并極有可能給PGD結(jié)果的判讀造成干擾。研究表明，ADO發(fā)生率可以高達30%～40%，且單個卵裂球WGA的ADO發(fā)生率高于淋巴細胞、極體和成纖維細胞。一般認為SRY基因的脫扣率較為罕見，但Ye等的研究表明，SRY的ADO發(fā)生率可能并不像之前預(yù)期的那樣。由于ADO現(xiàn)象無法避免，因此采用盡可能多的位點進行判別是克服ADO干擾的有效方法。

由于存在ADO或交換，將無可避免地導(dǎo)致PGD存在一定的診斷錯誤率。因此，建議所有通過PGD成功妊娠的孕婦，均應(yīng)該在妊娠中期接受羊膜腔穿刺，對胎兒進行產(chǎn)前基因檢測，以防止因PGD診斷錯誤導(dǎo)致的異常嬰兒出生。